nouvèl

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) se yon analogue nan substra β-galactosidase, ki se trè inducible.Anba endiksyon IPTG, pwodiktè a ka fòme yon konplèks ak pwoteyin represor a, se konsa ke konfòmasyon pwoteyin represor a chanje, se konsa ke li pa ka konbine avèk jèn sib la, epi jèn sib la eksprime avèk efikasite.Se konsa, ki jan yo ta dwe detèmine konsantrasyon nan IPTG pandan eksperyans la?Èske pi gwo a pi bon?
Premyèman, ann konprann prensip endiksyon IPTG la: operon laktoz E. coli (eleman) gen twa jèn estriktirèl, Z, Y, ak A, ki kode β-galactosidase, pèmeaz, ak asetiltransferaz, respektivman.lacZ idrolize laktoz nan glikoz ak galaktoz, oswa nan allo-laktoz;lacY pèmèt laktoz nan anviwònman an pase nan manbràn selilè a epi antre nan selil la;lacA transfere gwoup asetil la soti nan asetil-CoA nan β-galactoside, ki enplike nan retire efè toksik.Anplis de sa, gen yon sekans fonksyònman O, yon sekans kòmanse P ak yon jèn regilasyon I. Kòd jèn I a se yon pwoteyin represseur ki ka mare nan pozisyon O nan sekans operatè a, se konsa ke operon an (meta) reprime ak fèmen.Genyen tou yon sit obligatwa pou katabolik jèn activator pwoteyin-CAP obligatwa sit en nan sekans inisye P. Sekans nan P, sekans O ak sit obligatwa CAP ansanm konstitye rejyon an regilasyon nan operon lac la.Jèn kodaj twa anzim yo reglemante pa menm rejyon an pou reyalize ekspresyon kowòdone pwodwi jèn yo.

Nan absans laktoz, lak operon (meta) nan yon eta de represyon.Nan moman sa a, represor lac ki eksprime pa sekans I a anba kontwòl sekans pwomotè PI a mare nan sekans O a, ki anpeche RNA polymerase lye nan sekans P a epi anpeche inisyasyon transkripsyon an;lè laktoz prezan, lak operon (meta) ka pwovoke Nan sistèm operon (meta) sa a, vrè induktè a se pa laktoz tèt li.Laktoz antre nan selil la epi li katalize pa β-galactosidase pou l konvèti an alolaktoz.Lèt la, kòm yon molekil endiktè, mare nan pwoteyin repressè a epi chanje konfòmasyon pwoteyin lan, ki mennen nan disosyasyon pwoteyin repressè a soti nan sekans O ak transcription.Isopropylthiogalactoside (IPTG) gen menm efè ak allolaktoz.Li se yon pwodiktè trè pwisan, ki pa metabolize pa bakteri epi li trè estab, kidonk li se lajman ki itilize nan laboratwa.

Ki jan yo detèmine konsantrasyon optimal nan IPTG?Pran E. coli kòm yon egzanp.
Souch E. coli BL21 jenetikman enjenyè ki gen pGEX recombinant pozitif (CGRP/msCT) te vaksinen nan mwayen likid LB ki gen 50μg·mL-1 Amp, ak kiltive lannwit lan nan 37 °C.Kilti ki anwo a te vaksinen nan 10 boutèy 50mL fre mwayen likid LB ki gen 50μg · mL-1 Amp nan yon rapò 1:100 pou kilti ekspansyon, epi lè valè OD600 la te 0.6 ~ 0.8, IPTG te ajoute nan konsantrasyon final la.Li se 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Apre endiksyon nan menm tanperati a ak menm tan an, yo te pran 1 mL nan solisyon bakteri a, epi selil bakteri yo te kolekte pa santrifujasyon epi yo te sibi SDS-PAGE pou analize enfliyans diferan konsantrasyon IPTG sou ekspresyon pwoteyin, ak Lè sa a. chwazi konsantrasyon IPTG ak pi gwo ekspresyon pwoteyin.
Apre eksperyans, li pral jwenn ke konsantrasyon nan IPTG se pa gwo ke posib.Sa a se paske IPTG gen yon sèten toksisite nan bakteri.Depase konsantrasyon an pral touye selil la tou;ak jeneralman pale, nou espere ke pwoteyin ki pi idrosolubl eksprime nan selil la, pi bon an, men nan anpil ka lè konsantrasyon nan IPTG twò wo, yo pral fòme yon gwo kantite enklizyon.Kò, men kantite pwoteyin idrosolubl diminye.Se poutèt sa, konsantrasyon IPTG ki pi apwopriye a souvan pa pi gwo a pi bon an, men pi ba konsantrasyon an.
Objektif endiksyon ak kiltivasyon tansyon jenetikman enjenieri se ogmante sede pwoteyin sib la epi redwi depans yo.Ekspresyon jèn sib la pa sèlman afekte pa pwòp faktè souch la ak plasmid ekspresyon an, men tou, pa lòt kondisyon ekstèn, tankou konsantrasyon pwodiktè a, tanperati endiksyon an ak tan endiksyon an.Se poutèt sa, an jeneral, anvan yon pwoteyin enkoni eksprime ak pirifye, li pi bon yo etidye tan an endiksyon, tanperati ak konsantrasyon IPTG yo nan lòd yo chwazi kondisyon ki apwopriye yo epi jwenn pi bon rezilta eksperimantal yo.